Captura de Leveduras da Natureza – Dra. Gabriela Müller

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INTRODUÇÃO

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Dra. Gabriela Müller é bioquímica especializada em microbiologia, sócia-proprietária da Levteck, professora da Escola Superior de Cerveja e Malte, cervejeira caseira e juíza de cervejas.

Nosso objetivo aqui é apresentar técnicas de captura de leveduras e bactérias da natureza para a produção de cervejas. Este é um processo diferente do que as cervejarias estão habituadas a executar, e por ser um tanto demorado, exige uma boa dose de paciência. O produto final, dependendo do processo e do resultado almejado, pode levar 2 anos, ou até mais, para ficar pronto.

Na primeira parte, focaremos no isolamento de culturas puras, ou seja, uma única cepa de levedura ou bactéria: quais são os preparativos necessários e como fazer a captura, isolamento, identificação e propagação. Vale ressaltar que, embora seja possível fazer isso em casa ou em uma cervejaria, é necessário algum conhecimento laboratorial, condições assépticas de trabalho, e equipamentos básicos de microbiologia.

Na segunda parte, abordaremos as culturas mistas, ou seja, culturas compostas por diferentes espécies de micro-organismos: quais são os preparativos necessários, como fazer a captura, e os testes sensoriais.

 

ISOLANDO CULTURAS PURAS

A primeira pergunta a ser respondida aqui é: qual tipo de micro-organismo eu desejo captar da natureza? As opções são inúmeras, entre bactérias e leveduras conhecidas, até as milhares de leveduras fermentativas que ainda não conhecemos.

Esta decisão inicial é importante, pois ela determinará os métodos que deverão ser usados na captura e isolamento daquele micro-organismo. Por exemplo, é possível usar métodos específicos para a seleção de micro-organismos selvagens, e da mesma forma para micro-organismos tradicionais da fermentação de cerveja, como as leveduras Brettanomyces ou Saccharomyces.

As bactérias existem em número muito maior na natureza do que as leveduras, e sempre estarão presentes nas capturas de micro-organismos da natureza. É preciso pensar em quais bactérias se deseja selecionar. A Acetobacter, por exemplo, é uma bactéria obrigatoriamente aeróbia, ou seja, ela precisa de oxigênio para converter o etanol em ácido acético. Portanto, se não desejamos isolar a Acetobacter, devemos usar concentrações mínimas de oxigênio, o que favorece o isolamento de bactérias produtoras de ácido lático, como Lactobacillus e Pediococcus, desejáveis em cervejas como Sour Beers, Lambics, etc.

Por isso, é preciso considerar quais são as condições ótimas de cada micro-organismo para determinar quais técnicas usaremos para isolá-los de forma correta.

 

Características gerais das principais leveduras e bactérias cervejeiras

 

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Saccharomyces

 

  • Eucarioto (levedura)
  • Produz biomassa (fase aeróbia), álcool (fase anaeróbia)
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Brettanomyces

 

  • Eucarioto (levedura)
  • Produz ácido acético (fase aeróbia), álcool (fase anaeróbia)
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Lactobacillus

 

  • Procarioto (bactéria)
  • Produz ácido lático
  • Não atenua o mosto, é inibida pelo lúpulo
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Pediococcus

 

  • Procarioto (bactéria)
  • Produz muito ácido lático (2x mais que Lactobacillus)
  • Produz diacetil / oleosidade
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Acetobacter

 

  • Procarioto (bactéria)
  • Produz ácido acético
  • Aeróbio obrigatório

 

PREPARAÇÃO

O primeiro passo para isolar micro-organismos é preparar o material de trabalho, e este processo é sempre o mesmo, tanto na captura de culturas puras como de culturas mistas.

Mais do que sanitizado, tudo precisa ser esterilizado. Não apenas os equipamentos e utensílios, mas também o próprio mosto. Laboratórios usam um autoclave para este fim, mas em casa é possível usar uma panela de pressão para simular um autoclave. Na panela de pressão, a temperatura máxima de fervura da água passa de 100 para 121°C a 1 atm de pressão, o que é suficiente para eliminar vírus – que, neste caso, não seriam um problema – e esporos de fungos, estes sim potenciais problemas, particularmente espécies produtoras de toxinas como o Aspergillus niger.

Muitos micro-organismos presentes na natureza consomem açúcares simples como glicose, frutose e sacarose. Porém, a maioria não consome maltose de forma eficiente. Por isso, devemos usar mostos ricos em maltose, seja a partir de grãos ou de extrato de malte, com densidade entre 7 e 10°P. A lupulagem é opcional, dependendo do micro-organismo que se deseja isolar. Se o objetivo é isolar um Lactobacillus, por exemplo, o mosto não deve ser lupulado. Se o objetivo é eliminar bactérias gram-positivas e isolar apenas leveduras, é possível fazer uma lupulagem mais alta.

 

Como esterilizar mosto na panela de pressão
Para esterilizar o mosto, ele pode ser colocado diretamente na panela de pressão, ou primeiro introduzido em um erlenmeyer, que por sua vez é colocado na panela de pressão, envolto por aproximadamente 5 cm de altura de água. Após pegar pressão, deixar por 15 minutos. Pronto!

 

Possíveis locais de captura

  • Frutas da estação, preferencialmente:
    • machucadas, pois nas cascas só encontramos leveduras selvagens, mas na polpa exposta é possível encontrar Saccharomyces; e
    • colhidas diretamente da natureza, pois as frutas de supermercado são lavadas e sanitizadas.
    • OBS: Nos experimentos conduzidos pela Levteck, percebemos que as frutas de inverno, especialmente as cítricas, têm maior presença de leveduras do gênero Saccharomyces.
  • Cascas de árvores
  • Pólen de flores
  • Locais tradicionais de fermentação, como alambiques, locais onde se produz pão, locais onde se processa e armazena cana de açúcar, etc.

 

Captura

Existem três métodos possíveis para a captura de micro-organismos da natureza: Cultura em potes direto do ambiente; A partir de frutas, vegetais, flores e árvores; e Cotonetes esterilizados (swab).

 

Cultura em potes direto do ambiente

Neste método, utiliza-se um recipiente, por exemplo um balde fermentador, tampado apenas com um voil previamente esterilizado, de modo que os micro-organismos presentes no ambiente possam entrar em contato com o mosto.

Quanto mais recipientes, e mais locais, maiores as chances de sucesso. Os micro-organismos captados irão variar de acordo com diversos fatores como o local, o clima, o vento, a estação do ano, entre outros. É um processo de tentativa e erro, portanto é possível captar um micro-organismo em um determinado local, e nunca mais conseguir captar o mesmo micro-organismo naquele mesmo local. Também pode ser interessante fazer ensaios para buscar perfis sensoriais diferentes. Usando mostos lupulados e não lupulados em um mesmo ambiente, por exemplo, a proporção de bactérias e leveduras será diferente.

Após 24h a 48h de exposição, o voil é retirado e o recipiente é tampado, com uma válvula airlock para evitar o acúmulo de pressão interna.

Uma vez captada, a cultura de diferentes micro-organismos começará a demonstrar atividade dentro de 30 a 50 dias. Esta atividade deve ser monitorada regularmente através de medições de densidade, pH, e análises sensoriais. Se o recipiente for grande (p. ex. um fermentador de 30 L), será necessário coletar amostras. Se o recipiente for pequeno (p. ex. um pote de conserva), será possível identificar atividade visualmente, através da formação de bolhas e/ou turbidez.

A partir deste ponto, é possível selecionar uma levedura ou bactéria específica em laboratório (cultura pura), ou trabalhar com a biomassa obtida, reutilizando-a em novas fermentações (cultura mista).

Para sabermos se, e quando, o processo deu certo, devemos acompanhar as medições até que se atinja a atenuação e/ou acidez previstas. Em geral, antes a acidez aumenta, e depois o mosto começa a atenuar.

 

Como saber se a bebida é segura para consumo?
Lembre-se sempre da seguinte regra: o que cresce no álcool não nos mata. Nenhum micro-organismo resistente a uma concentração acima de 4% de álcool é patogênico. Portanto, para garantir a salubridade de uma bebida feita a partir de fermentação espontânea, certifique-se de que há presença de álcool. Se a cerveja acidificar, mas não houver álcool, isso pode indicar a presença de enterobactérias e outros patógenos na cerveja. Neste caso, descarte o líquido e tente novamente.

 

Frutas, vegetais, flores e árvores

Este método consiste em introduzir o material (fruta, vegetal, etc) diretamente no mosto. O material não deve ser limpo de nenhuma forma, para não interferir na população de micro-organismos ali presentes. Da mesma forma que o método anterior, é possível trabalhar com mostos lupulados ou não, oxigenados em stir-plates ou não, conforme o tipo de micro-organismo que se deseja isolar.

 

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Experimentos com frutas conduzidos pela Levteck. : limão (esq.), goiaba (centro), pitanga (dir.). Fotos: Dra. Gabriela Müller

 

Após 30 a 50 dias, deve haver alguma atividade nos recipientes. Retirar o material do líquido é opcional.

Geralmente, as bactérias patogênicas – sempre presentes no ambiente e no nosso próprio corpo – se reproduzirão rapidamente no mosto. Com o tempo, as leveduras produzem álcool, com isso eliminando as bactérias nocivas. Em paralelo, as bactérias ácido-láticas vão crescendo.

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Portanto, se o objetivo for produzir uma uma Sour Beer a partir de fermentação espontânea (Lambic), será necessário ao menos 4 semanas de atividade. Independente da levedura ali presente, seja Saccharomyces, Brettanomyces, ou qualquer outra, o importante é garantir a atenuação do mosto, indicando a produção de álcool.

 

Cotonete esterilizado (swab)

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Neste método, usa-se o cotonete esterilizado, disponível em farmácias sob o nome “swab”, para coletar amostras. É possível coletar micro-organismos a partir de frutas, da superfície de um determinado local, ou mesmo do sedimento presente em uma garrafa ou copo de cerveja, por exemplo.

Basicamente, o cotonete é raspado na superfície do objeto ou local escolhido, e então acondicionado em um recipiente, seguindo os mesmos passos e orientações dos métodos anteriores, de modo a propagar aquela população de micro-organismos.

 

ISOLAMENTO

As técnicas de isolamento de micro-organismos são as mesmas, independentemente do método utilizado para a captura.

Existem meios de cultura específicos para isolamento de bactérias ou de leveduras. E, assim como os preparativos para a captura, aqui também é necessário um ambiente asséptico para evitar contaminações.

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Para fazer o isolamento é preciso usar uma alça de microbiologia (também chamada de alça loop), devidamente esterilizada, introduzi-la no recipiente onde os micro-organismos foram capturados, e passar na superfície de um meio de cultura usando um dos diversos métodos de estriamento (abaixo), o que auxiliará na identificação dos diferentes tipos de colônia.

Existem algumas maneiras de identificar colônias de micro-organismos. Uma delas é verificando a produção de ácido. Tanto a levedura Brettanomyces quanto as bactérias Lactobacillus e Pediococcus produzem ácido. Portanto, se desejamos isolar leveduras Brettanomyces, podemos usar um meio de cultura específico para leveduras e que indica a produção de ácido.

Outra maneira de identificar a colônia é observar a sua morfologia, ou seja, características visuais como formato, cor, textura, etc. Colônias de leveduras geralmente são brancas ou bastante claras, opacas, formam elevações (“morrinhos”), e em geral têm bordas lisas ou levemente irregulares. Já colônias de bactérias tendem a ser brilhantes, são menores do que as colônias de leveduras, não têm elevação, apresentam textura gosmenta e bordas irregulares.

A morfologia ajuda a identificar possíveis contaminantes. Por exemplo, bordas irregulares em forma de rizomas e filamentos indicam colônias formadores de toxinas. Colônias puntiformes também apresentam risco. A imagem abaixo mostra colônias de leveduras Saccharomyces (pontos brancos) e colônias de Staphylococcus aureus (pontos amarelos) em um mesmo meio de cultura.

 

 

Além de escolher o meio de cultura certo e verificar a morfologia das colônias, é preciso separar cada colônia tantas vezes quanto isso for necessário e/ou viável.

 

Método do Carimbo

Uma maneira de selecionar leveduras cervejeiras é o método do carimbo. Na imagem a seguir temos dois tipos de placa: as placas de cima selecionam leveduras totais, ou seja, qualquer tipo de levedura pode crescer nestes meios de cultura; e as placas de baixo são seletivas para leveduras selvagens, ou seja, apenas leveduras que não são do gênero Saccharomyces crescem nestes meios de cultura.

 

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O método do carimbo envolve coletar uma amostra de cada colônia das placas de leveduras totais, e passar para a mesma posição nas placas seletivas para leveduras selvagens. Se a colônia crescer na segunda placa, aquelas colônias são de leveduras selvagens (placas 16 – 32, à esquerda na imagem acima). Se não crescerem, trata-se de colônias de leveduras cervejeiras (placas 32 – 48, à direita).

Uma vez isolada e purificada, a levedura escolhida é propagada e usada na produção de uma cerveja, para avaliar o seu perfil sensorial.

No entanto, mesmo após todos estes processos, não há garantia de que a levedura irá de fato fermentar o mosto. Acontece! A captação de leveduras da natureza é um processo muito longo e incerto, e por isso é interessante fazer vários testes, se possível em paralelo, para aumentar as chances de sucesso.

 

Curiosidade
Todas as leveduras Saccharomyces consomem maltose, mas menos de 2% de todas as leveduras encontradas na natureza são Saccharomyces. Por isso, todas as cepas de leveduras utilizadas atualmente na produção de cerveja foram originalmente capturadas em cervejarias, que as domesticaram de forma empírica ao longo dos séculos, até que elas tivessem a capacidade de consumir maltose e maltotriose.

 

Resultados

Segue abaixo o registro de uma Lambic produzida na Levteck usando a captura com o balde aberto. Vale destacar que a Levteck produz leveduras para a indústria cervejeira, portanto a proporção de leveduras no quintal da empresa, onde esta captura foi realizada, certamente é mais elevada do que em outros locais.

 

LEVTECK LAMBIC
Fase Inicial Fermentação Após 2 meses de Fermentação Maturação
Enterobactérias Saccharomyces
  • OG: 13,15°P
  • Ea: 0,93°P
  • ADF: 92,92%
  • ABV: 6,5%
  • pH: 3,5
Sequenciamento em andamento

 

Abaixo, uma visão geral do que se pode esperar em cada fase de uma cerveja produzida através de fermentação espontânea.

 

1. Fase Inicial

  • Klebsiella
  • Enterobacter
  • Escherichia
  • Citrobacter
  • Serratia
  • Pectobacterium
  • Non-Saccharomyces: Kluyveromyces e Rhodotorula

2. Fermentação

  • Redução do pH
  • Fermentação açúcares
  • Fermentação alcoólica
  • Sabores e aromas de Saccharomyces e produção de ácido lático
  • Saccharomyces
  • Non-Saccharomyces

3. Maturação

  • Saccharomyces é substituída pela Brettanomyces
  • Pediococcus
  • Consumo dos açúcares complexos
  • Formações dos sabores característicos de cervejas Lambics

 

Nos gráficos abaixo, observa-se a evolução da proporção entre leveduras e bactérias em Lambics.

 

Clique para aumentar. Fonte

 

Na tabela e gráficos abaixo, observa-se os resultados obtidos pela Levteck em leveduras isoladas a partir de frutas.

 

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Nota-se que a maioria tem uma grande atenuação e perfil sensorial predominantemente fenólico. Porém, experimentos recentes da Levteck vêm apresentando resultados mais favoráveis, com leveduras menos atenuantes e com perfil mais esterificado.

Obrigada!

 


 

PERGUNTAS

Com a intenção de maximizar as chances de sucesso, qual seria a melhor época do ano para fazer a captura de leveduras da natureza, por exemplo aqui em Porto Alegre? E quando devemos começar a controlar a temperatura após a coleta?
Não só em Porto Alegre, mas sim em qualquer local que tenha um período de temperaturas baixas, é recomendável começar pelo inverno. Bergamota, limão, laranja, frutas cítricas que dão no inverno, de modo geral, são um ponto de partida promissor. No verão, especialmente em locais muito quentes, onde a temperatura passa de 35°C, as bactérias se tornam presentes em número imensamente maior do que as leveduras.

Quanto ao controle de temperatura, se for uma fermentação mista, mantenha sempre em temperatura ambiente, pois o próprio clima permitirá a ciclagem de temperatura e fará uma seleção de populações. No verão, bactérias como a Pediococcus se desenvolvem mais, e no inverno, é a vez de leveduras como a Brettanomyces. Isso é importante para uma cultura mista. Mas não devemos deixar passar da faixa dos 30°C. No caso de culturas puras, o controle de temperaturas deve começar a partir do isolamento. De modo geral, o starter deve ser feito entre 20 e 22°C, e a fermentação entre 18 e 20°C (em média). A partir deste ponto, é possível ajustar a temperatura de fermentação conforme o perfil sensorial desejado: se o desejo é por mais ésteres, deve-se fermentar a temperaturas mais altas; se a intenção é um perfil mais fenólico, temperaturas mais baixas.

Fiz todo o processo e escolhi a minha levedura. Como devo armazená-la?
Um método de armazenamento é chamado de Slant, que consiste basicamente em um tubo inclinado, armazenado em uma geladeira. Esta é a maneira mais fácil de se armazenar leveduras, e cada matriz dura de 1 a 2 anos. Após este período, é preciso fazer uma nova propagação.

Outro método é a criopreservação, que envolve misturar a levedura com um osmoprotetor (normalmente glicerol) e armazená-la em um freezer. Em um contexto caseiro, a temperatura pode ser -20°C, normal para um freezer comum, mas em laboratório trabalhamos com -80°C. Um detalhe importante é que o freezer não pode ser frost-free, pois este tipo de freezer reduz periodicamente a temperatura interna para evitar a formação de gelo, o que estressa a levedura e pode causar a sua morte. Uma vez que a levedura congela, ela deve permanecer congelada até ser utilizada.

O Pediococcus é tolerante ao lúpulo?
Sim, o Pediococcus é totalmente tolerante ao lúpulo. Também é possível fazer kettle-sour com o Pediococcus. Provavelmente ele produzirá acidez antes do diacetil, mas caso ele produza um pouco de diacetil, a levedura irá removê-lo depois. E como ele produz muito mais ácido láctico que o Lactobacillus, e é resistente ao lúpulo, seria uma boa ideia. Eu só não usaria o Pediococcus naquele método apresentado pelo Jerry*, porque uma vez que o Pediococcus se instalar na cervejaria, não sai nunca mais. O Lactobacillus é um pouco menos perigoso do que o Pediococcus neste sentido. O Pediococcus é tolerante ao álcool e ao lúpulo, mas o seu maior inimigo, ao qual é extremamente intolerante, é o oxigênio.

* em breve aqui no blog da Krater.

A respeito do balde com mosto que fica no quintal, ele deve ficar em um lugar coberto, ou não?
Não necessariamente. É preferível evitar a chuva, mas quanto ao orvalho não tem problema.
Qual é a frequência de se encontrar Staphylococcus ao coletar leveduras da natureza?
Na natureza, é menos frequente do que as enterobactérias. Geralmente, o Staphylococcus vem de uma contaminação nossa, pois as nossas feridas, pus, algumas espinhas quando infeccionam, a nossa pele, tudo isso está coberto de Staphylococcus aureus.
Depois de capturar a levedura da natureza com o balde aberto, devo mantê-lo aberto ou fechado?
Após a captura, sempre fechado e com airlock. Durante a captura, deixar sempre coberto com o voil, pois se deixar o balde completamente exposto, todos os insetos da região serão atraídos pelo mosto, e eles são os principais veiculadores de bactérias acéticas.

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